準確(que)檢(jian)測食品過敏(min)(min)原對加(jia)強食品安全管理(li)至關重要(yao)。有效合(he)理(li)的(de)預處理(li)方(fang)法可以(yi)減少雜(za)質的(de)干(gan)擾(rao)，提(ti)高過敏(min)(min)原的(de)提(ti)取(qu)效率，從而對檢(jian)測的(de)靈敏(min)(min)度和準確(que)性起(qi)到(dao)重要(yao)作用(yong)。

2024年4月，南昌大學陳紅兵教授團隊在Food Chemistry（IF=8.4）上發(fa)(fa)表(biao)題目為Lipid matrix-specific pretreatment method for enhancing the extractability and allergenicity maintenance of bovine milk allergens in ELISA detection的(de)(de)研究成(cheng)果(guo)。該(gai)研究開發(fa)(fa)了(le)一種針對脂(zhi)質(zhi)(zhi)基質(zhi)(zhi)的(de)(de)預處理的(de)(de)方法。然后利用蛋白(bai)質(zhi)(zhi)組學分析確認了(le)預處理對過敏(min)原(yuan)提(ti)取效果(guo)的(de)(de)影響。該(gai)研究為食(shi)品(pin)過敏(min)原(yuan)檢測提(ti)供(gong)了(le)新策略，強調(diao)了(le)匹配食(shi)品(pin)基質(zhi)(zhi)和過敏(min)原(yuan)類(lei)型的(de)(de)預處理方法的(de)(de)重要性。

青(qing)蓮百奧為(wei)該研究(jiu)提供蛋白質譜檢測(ce)和分析服務。

研究思路

1. 根據(ju)成分特(te)性(xing)，將食品基質進行分類，特(te)別是針對脂質基質。

2. 結合超聲(sheng)輔助正己烷脫(tuo)脂和弱堿(jian)性(xing)提取(qu)系統(tong)，為(wei)牛乳過(guo)敏原開發特定的預處理方法。

3. 使用免疫學定(ding)量和光譜分(fen)析來評估(gu)過敏原的提取效率(lv)。

4. 通(tong)過LC-MS/MS分(fen)析、KU812細胞脫顆(ke)粒模(mo)型和西方印(yin)跡法來確認過敏原(yuan)性是(shi)否(fou)得到保持。

5. 對準確性(xing)（Bias）、重(zhong)復性(xing)（RSDr）、穩(wen)定(ding)性(xing)（RSDR）進行評(ping)估(gu)。

6. 將預(yu)處理方法應用于20種商業食品，并與(yu)商業ELISA試劑盒比較。

7. 使用LCSM（激(ji)光共聚焦掃(sao)描顯微(wei)(wei)鏡）和SEM（掃(sao)描電子顯微(wei)(wei)鏡）觀察預處理(li)后脂肪和蛋白質的微(wei)(wei)觀結構變化。

8. 測(ce)量提取(qu)物的粒徑(jing)和(he)zeta電位，評(ping)估分散系(xi)統的穩定性。

研究結果

一、不同提取方法對牛乳變應原提取性能及蛋白質結構的影響

通過(guo)(guo)對比(bi)12種緩沖(chong)(chong)液(ye)(ye)，研究發(fa)現弱(ruo)堿性緩沖(chong)(chong)液(ye)(ye)（如(ru)PBS 8.2）更有效(xiao)(xiao)地提(ti)(ti)取牛乳過(guo)(guo)敏(min)原(yuan)，且對蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)結(jie)構破壞較(jiao)小。SDS-PAGE分(fen)析(xi)表明醋(cu)酸(suan)和檸檬酸(suan)緩沖(chong)(chong)液(ye)(ye)處理的(de)樣品電泳帶(dai)型(xing)有顯(xian)著(zhu)(zhu)差(cha)異，不利于蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)提(ti)(ti)取和結(jie)構維(wei)持。CD（圓二色光譜）和內源熒(ying)光光譜分(fen)析(xi)顯(xian)示(shi)弱(ruo)堿性緩沖(chong)(chong)液(ye)(ye)有助于保持蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)的(de)二級和三級結(jie)構。ELISA測定(ding)發(fa)現PBS 8.2和TBS 8.2在提(ti)(ti)取主要牛乳過(guo)(guo)敏(min)原(yuan)ALA、BLG和CSN方面最有效(xiao)(xiao)。據此，建立了三種優(you)化的(de)過(guo)(guo)敏(min)原(yuan)預(yu)處理方法(fa)（ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre），顯(xian)著(zhu)(zhu)提(ti)(ti)升了提(ti)(ti)取效(xiao)(xiao)率和檢測準確性（圖1）。

圖1 用BLG-Pre和商品(pin)試劑(ji)盒前處(chu)理方法(fa)分析(xi)不同商品(pin)食品(pin)中BLG的(de)回收率

二、不同前處理方法的過敏原提取液蛋白質組學分析

在蛋(dan)白質組(zu)學分(fen)析(xi)中，不同預處理方(fang)法對牛乳過敏原(yuan)提取物的(de)蛋(dan)白質組(zu)成和(he)相對含量有顯著影(ying)響。ALA-Pre、BLG-Pre和(he)CSN-Pre三(san)種(zhong)方(fang)法分(fen)別鑒(jian)定(ding)出500、470和(he)481種(zhong)蛋(dan)白質，其中451種(zhong)為共同鑒(jian)定(ding)，而(er)每種(zhong)方(fang)法獨特鑒(jian)定(ding)的(de)蛋(dan)白質分(fen)別為7、1和(he)4種(zhong)。層次(ci)聚類分(fen)析(xi)發(fa)現138種(zhong)顯著差異蛋(dan)白，熱圖(tu)顯示BLG-Pre形(xing)成獨立聚類，ALA-Pre和(he)CSN-Pre形(xing)成亞簇，與PCA分(fen)析(xi)一致(zhi)。

深入分析七種(zhong)常見(jian)過敏(min)原(yuan)，包括α-乳白(bai)(bai)(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)、β-乳球蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)等，氣泡圖(tu)和補充表S3顯示(shi)三種(zhong)預處理方法對特定過敏(min)原(yuan)提(ti)(ti)取(qu)具有特異性(xing)。ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre組(zu)中豐(feng)度(du)最高(gao)的(de)過敏(min)原(yuan)分別(bie)為κ-酪(lao)(lao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)、κ-酪(lao)(lao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)和αs2-酪(lao)(lao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，反映(ying)了酪(lao)(lao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)高(gao)含(han)量和提(ti)(ti)取(qu)效率(lv)。特別(bie)是αs2-酪(lao)(lao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，在CSN-Pre組(zu)中的(de)豐(feng)度(du)顯著(zhu)高(gao)于(yu)其他組(zu)。

圖2 過敏(min)原提取物的(de)蛋白(bai)質(zhi)組學分析(xi)。（A）蛋白(bai)質(zhi)數量(liang)，（B）PCA分析(xi)，（C）差異蛋白(bai)質(zhi)聚類(lei)分析(xi)，（D）常見牛奶過敏(min)原的(de)相對豐度

三、脂質基質食品過敏原提取物的過敏原性維持及方法驗證

通(tong)過(guo)KU812細胞脫(tuo)顆粒(li)模型評估了(le)不同預處(chu)理(li)方(fang)法(fa)(fa)對牛(niu)乳(ru)過(guo)敏原(yuan)過(guo)敏原(yuan)性(xing)的(de)(de)影響。實驗結果(guo)顯示，與(yu)對照組相比，所有(you)預處(chu)理(li)提取物均能顯著(zhu)誘(you)導(dao)細胞釋放β-己糖(tang)苷酶(mei)、組胺、IL-4和IL-6，表明過(guo)敏原(yuan)性(xing)未受損(sun)害。此(ci)外，Western blotting分(fen)析證實了(le)預處(chu)理(li)后(hou)的(de)(de)過(guo)敏原(yuan)保持了(le)與(yu)對照組相似的(de)(de)IgG結合能力，沒有(you)顯著(zhu)變(bian)化(hua)（圖3）。這(zhe)些結果(guo)表明，所建立(li)的(de)(de)預處(chu)理(li)方(fang)法(fa)(fa)有(you)效保持了(le)牛(niu)乳(ru)過(guo)敏原(yuan)的(de)(de)免疫反應性(xing)和過(guo)敏原(yuan)性(xing)。

分析(xi)ELISA數據后，顯示預(yu)處理方法(fa)具有出色(se)的(de)(de)準確性(xing)(xing)(xing)（偏差均(jun)值分別為(wei)-8.47%、-7.94%和-8.90%）。ALA-Pre的(de)(de)重復性(xing)(xing)(xing)和穩定性(xing)(xing)(xing)（RSDr為(wei)1.52%，RSDR為(wei)5.65%），BLG-Pre（RSDr為(wei)0.77%，RSDR為(wei)3.84%），以及CSN-Pre（RSDr為(wei)2.54%，RSDR為(wei)6.81%）均(jun)在(zai)可接受范(fan)圍內(nei)，證(zheng)明了這(zhe)些預(yu)處理方法(fa)在(zai)提取牛乳過敏原時的(de)(de)準確性(xing)(xing)(xing)、重復性(xing)(xing)(xing)和穩定性(xing)(xing)(xing)。

圖3 使用相應的兔血清(qing)對過敏原進行蛋白質印跡分析。(A) ALA，(B) BLG，(C) CSN

四、商品試劑盒在實際加工食品中的實際應用比較

在實際食(shi)品(pin)中(zhong)的(de)(de)(de)應用測試(shi)顯(xian)(xian)示，與商業試(shi)劑盒(he)相比，新開發的(de)(de)(de)預處理方(fang)(fang)法在提取高(gao)脂(zhi)食(shi)品(pin)中(zhong)的(de)(de)(de)牛乳過(guo)敏原方(fang)(fang)面更有效(xiao)，特別是在提取ALA和(he)BLG時(shi)，含量(liang)顯(xian)(xian)著高(gao)于(yu)商業試(shi)劑盒(he)。此外(wai)，通過(guo)LCSM和(he)SEM成(cheng)像(xiang)，新方(fang)(fang)法在脫脂(zhi)和(he)過(guo)敏原釋放方(fang)(fang)面表現更優，誘導形成(cheng)了更松散的(de)(de)(de)微結構（圖4）。粒子(zi)尺寸和(he)Zeta電(dian)位的(de)(de)(de)測量(liang)結果進一步證實了新預處理方(fang)(fang)法在形成(cheng)穩定分散系(xi)統方(fang)(fang)面的(de)(de)(de)優勢，從而提高(gao)了過(guo)敏原的(de)(de)(de)提取效(xiao)率和(he)穩定性（圖5）。

圖(tu)4 LCSM(A)觀(guan)察脂質分布，掃描(miao)電(dian)子顯微(wei)鏡(jing)(B)觀(guan)察超微(wei)結(jie)構。放大倍數(shu)為(wei)10k

圖5 過(guo)敏原提(ti)取物的粒徑(A)和zeta電位(B)

研究結論

本研(yan)究(jiu)創新(xin)性地根(gen)據(ju)食品(pin)基質(zhi)(zhi)的組成(cheng)特性分類，并為(wei)脂質(zhi)(zhi)基質(zhi)(zhi)中的牛乳過(guo)敏(min)(min)原檢測開發(fa)了匹(pi)配的預處(chu)理(li)方法。研(yan)究(jiu)結果(guo)為(wei)食品(pin)過(guo)敏(min)(min)風險管理(li)提供了科學依據(ju)，并指出(chu)了根(gen)據(ju)食品(pin)基質(zhi)(zhi)和過(guo)敏(min)(min)原類型匹(pi)配相應預處(chu)理(li)方法的必要性。