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為科研減負，計量大學實地考察落實DMB血液深度

近日，中國(guo)計量大學基于肝癌的(de)(de)血清樣本對比了美(mei)國(guo)Thermo Scientific公司的(de)(de)Top14高豐(feng)度蛋(dan)(dan)白(bai)去除(chu)試劑(ji)盒(he)和(he)(he)青蓮百奧血液低豐(feng)度蛋(dan)(dan)白(bai)富(fu)集試劑(ji)盒(he)（DMB）去除(chu)血清蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)組高豐(feng)度的(de)(de)效果[1]。結果表(biao)明DMB處理后的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)鑒(jian)定量在(zai)對照樣本和(he)(he)疾病(bing)樣本中分別是Top14的(de)(de)2.6和(he)(he)3.7倍(bei)，且DMB處理后低豐(feng)度蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)的(de)(de)鑒(jian)定覆蓋率(lv)更高。

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圖1：3 種血清蛋白質組樣本制備方案的技術路線^[1]

研究思路和關鍵結果

使用DMB、Top14兩種(zhong)血清樣本前處理試(shi)劑盒以及Blank對(dui)照，完(wan)成(cheng)3例健康人和3例肝癌患者的血清蛋(dan)白質(zhi)組分析；
DMB處理組鑒定的蛋白(bai)(bai)質組和(he)肽段數目最(zui)高(gao)且(qie)富集的低(di)豐度蛋白(bai)(bai)數量更(geng)多；
DMB處理組鑒定(ding)的差異蛋白最(zui)多；
DMB處(chu)理組鑒定的蛋白質的GO和(he)KEGG分析(xi)結果遠比Top14處(chu)理組和(he) Blank組豐富；
DMB處理組篩選出6個特征蛋白，可作(zuo)為肝癌篩查(cha)候選生物(wu)標志(zhi)物(wu)。

研究結果

一、肝癌血清樣本蛋白質和多肽的鑒定

該(gai)研究分(fen)(fen)別采用了(le)DMB、Top14兩種血(xue)清(qing)(qing)樣本(ben)前處(chu)(chu)(chu)理(li)試劑盒以及Blank對照，完成了(le)3例健康人和(he)3例肝(gan)癌患者的(de)血(xue)清(qing)(qing)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)分(fen)(fen)析。在(zai)各樣本(ben)中(zhong)(zhong)，Top14處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)和(he)肽(tai)段鑒(jian)定(ding)數(shu)目均高(gao)(gao)于Blank組(zu)(zu)(zu)(zu)，DMB處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)鑒(jian)定(ding)的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)和(he)肽(tai)段數(shu)目最高(gao)(gao)（圖2a）。在(zai)HC中(zhong)(zhong)，DMB處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)特(te)征鑒(jian)定(ding)的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)數(shu)量是 Top14處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)2.6倍(bei)(bei)(bei)，是Blank組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)3.9倍(bei)(bei)(bei)；在(zai)HCC中(zhong)(zhong)，DMB處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)特(te)征鑒(jian)定(ding)的(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)數(shu)量是Top14處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)3.7倍(bei)(bei)(bei)，是Blank組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)6.2倍(bei)(bei)(bei)。此外，Top14處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)和(he)Blank組(zu)(zu)(zu)(zu)鑒(jian)定(ding)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)豐(feng)度信息相(xiang)近，DMB處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)鑒(jian)定(ding)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)的(de)豐(feng)度較低（圖2d）。綜合表明，DMB方(fang)案在(zai)富集血(xue)清(qing)(qing)樣本(ben)中(zhong)(zhong)的(de)低豐(feng)度蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)效(xiao)果最佳。

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圖2：蛋白質(zhi)和多肽的鑒定(ding)情(qing)況

二、3種血清樣本前處理方案的穩定性評價

該(gai)研究分別基(ji)于Proteome Discoverer搜(sou)庫(ku)和MaxQuant搜(sou)庫(ku)結果統計蛋(dan)(dan)白鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)穩定(ding)(ding)(ding)性和定(ding)(ding)(ding)量穩定(ding)(ding)(ding)性。在HC中，DMB處(chu)理(li)(li)組(zu)(zu)(zu)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)頻率為(wei)2的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)數(shu)(shu)目(mu)高于其(qi)他兩組(zu)(zu)(zu)，比Top14處(chu)理(li)(li)組(zu)(zu)(zu)多(duo)(duo)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)43個（57.3%），比Blank組(zu)(zu)(zu)多(duo)(duo)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)68個（136%）；DMB處(chu)理(li)(li)組(zu)(zu)(zu)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)頻率為(wei)3的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)數(shu)(shu)目(mu)同樣高于其(qi)他兩組(zu)(zu)(zu)，比Top14處(chu)理(li)(li)組(zu)(zu)(zu)多(duo)(duo)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)69個（25.3%），比Blank組(zu)(zu)(zu)多(duo)(duo)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)143個（71.9%）（圖3a）。在HCC中，DMB處(chu)理(li)(li)組(zu)(zu)(zu)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)頻率高的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)數(shu)(shu)目(mu)依然高于其(qi)他兩組(zu)(zu)(zu)，增(zeng)加(jia)幅度比在HC中大（圖3b）。但是DMB處(chu)理(li)(li)組(zu)(zu)(zu)的(de)穩定(ding)(ding)(ding)性相對較差，這與鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)(ding)(ding)頻率為(wei)2的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)數(shu)(shu)目(mu)較多(duo)(duo)有(you)密(mi)切關系(xi)（圖3c,d）。

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圖(tu)3：3種血清樣本前(qian)處理方(fang)案(an)的穩(wen)定(ding)性評價

三、各方案特征鑒定蛋白質的GO和KEGG分析

使用clusterProfile分(fen)別對各組(zu)(zu)實驗在HC和HCC中(zhong)特征(zheng)鑒定(ding)的蛋(dan)白質進行GO和KEGG分(fen)析。DMB處(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)特征(zheng)鑒定(ding)的蛋(dan)白質的GO和KEGG富集(ji)結(jie)果均最豐富，相對于Top14處(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)和Blank組(zu)(zu)有顯著變化（圖4a），在KEGG富集(ji)結(jie)果中(zhong)表現得最為明顯。DMB處(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)特征(zheng)鑒定(ding)的蛋(dan)白質主(zhu)要參與(yu)的信號(hao)通路(lu)有ECM-受體相互作用、白細(xi)胞(bao)跨內皮遷移和肌動蛋(dan)白細(xi)胞(bao)骨架的調節等。

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圖4：各(ge)方(fang)案特征鑒定蛋(dan)白質的(de)GO和KEGG分析

四、健康人群和肝癌人群血清樣本差異蛋白質組分析

該研究基(ji)(ji)于(yu)健(jian)康(kang)人群(qun)(qun)和肝癌(ai)人群(qun)(qun)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)血(xue)清樣(yang)本，比較了DMB和Top14血(xue)液(ye)樣(yang)本前處理(li)試劑盒相對(dui)于(yu)血(xue)清原液(ye)在蛋(dan)(dan)白(bai)質組(zu)差異(yi)(yi)分(fen)析中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)優勢(shi)。Blank組(zu)共獲得(de)(de)17 個差異(yi)(yi)蛋(dan)(dan)白(bai)，Top14處理(li)組(zu)共獲得(de)(de)15個差異(yi)(yi)蛋(dan)(dan)白(bai)，DMB處理(li)組(zu)共獲得(de)(de)47個差異(yi)(yi)蛋(dan)(dan)白(bai)，在肝癌(ai)人群(qun)(qun)中表達上(shang)調的(de)(de)(de)(de)(de)(de)有(you)41個，下調的(de)(de)(de)(de)(de)(de)有(you)6個（圖(tu)5a-e）。差異(yi)(yi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PCA分(fen)析可(ke)以很好(hao)地區分(fen)健(jian)康(kang)人群(qun)(qun)和肝癌(ai)人群(qun)(qun)。3組(zu)實驗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)差異(yi)(yi)蛋(dan)(dan)白(bai)質組(zu)分(fen)析均可(ke)發現在肝癌(ai)血(xue)清樣(yang)本中顯著上(shang)調的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，但在獲得(de)(de)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)差異(yi)(yi)基(ji)(ji)因(yin)(yin)數量上(shang)和所行(xing)使的(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能(neng)上(shang)有(you)所不同，這(zhe)對(dui)于(yu)理(li)解肝癌(ai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)發生發展分(fen)子機制有(you)影響。

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圖5：Blank、Top14和DMB樣(yang)本(ben)制備方案肝癌血清樣(yang)本(ben)差異蛋白質組分析

五、基于DMB組差異基因的PPI分析

基(ji)于上(shang)述分(fen)析結果，相較于Blank組和(he)(he)Top14處(chu)理組，DMB處(chu)理組對(dui)血清中(zhong)低豐度蛋(dan)白的鑒(jian)定效果有顯(xian)著提升，特征鑒(jian)定蛋(dan)白的功能富集結果更加豐富，發現(xian)的差(cha)異表達基(ji)因數量明顯(xian)增多。使(shi)用String對(dui)DMB組差(cha)異基(ji)因進行(xing)蛋(dan)白質(zhi)互(hu)作網絡(luo)（protein-protein interaction networks,PPI）分(fen)析。該(gai)網絡(luo)圖(tu)包含37個(ge)節點，其中(zhong)HSP90AB1、SPP1、ACTR3、SNCA、PECAM1和(he)(he)SRC在(zai)健康人(ren)群和(he)(he)肝癌人(ren)群中(zhong)表現(xian)出顯(xian)著差(cha)異（圖(tu)6b），可(ke)作為肝癌篩(shai)查候選生物(wu)標志物(wu)。

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圖6：基于DMB前處(chu)理方案在(zai)肝癌血清樣本的差異蛋白質組分析

研究結論

本研(yan)究(jiu)討論了基于Top14和(he)DMB血液(ye)(ye)樣(yang)本前處(chu)(chu)(chu)理(li)試劑盒相對(dui)于血清原液(ye)(ye)在(zai)(zai)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)分析(xi)中的(de)(de)優勢，以(yi)及Top14和(he)DMB2種試劑盒在(zai)(zai)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)組(zu)(zu)(zu)(zu)分析(xi)中的(de)(de)優劣勢。在(zai)(zai)肽段和(he)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)鑒定(ding)(ding)方面，DMB處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)鑒定(ding)(ding)數量(liang)遠(yuan)高于Top14 處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)和(he)Blank組(zu)(zu)(zu)(zu)。DMB處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)對(dui)低豐度蛋白(bai)(bai)的(de)(de)鑒定(ding)(ding)有更好的(de)(de)結(jie)果(guo)。DMB特征鑒定(ding)(ding)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)GO和(he)KEGG分析(xi)結(jie)果(guo)遠(yuan)比(bi)Top14處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)和(he)Blank組(zu)(zu)(zu)(zu)豐富(fu)，證(zheng)明了DMB處(chu)(chu)(chu)理(li)組(zu)(zu)(zu)(zu)鑒定(ding)(ding)蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)多樣(yang)性。

參考文獻

[1]趙(zhao)佳威,陸澳,趙(zhao)洋等.血清(qing)蛋(dan)白(bai)質組(zu)高豐度蛋(dan)白(bai)去除方法比較研究[J/OL].質譜學報:1-12[2023-03-20].//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20240318.1717.003.html.

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