2024年8月，瑞士蘇黎世聯邦理工學院Paola Picotti團隊在期刊Nat Chem Biol（IF=12.9）上發表了題為“In situ analysis of osmolyte mechanisms of proteome thermal stabilization”的研究論文，該研究創新性地結合TPP和LiP-MS深入剖析滲透劑在細胞內如何調控蛋白質組的熱穩定性。研究不僅揭示了滲透劑對蛋白質結構和穩定性的深遠影響，還闡明了它們在多樣化溫度環境下對蛋白質保護及聚集行為的精細調控機制，為生物技術領域和藥物開發中有效利用這些天然分子開辟了新思路和策略。

滲透機制

滲透機制是細胞適應環境變化的關鍵策略之一。滲透劑如甜菜堿和三甲胺-N-氧化物（TMAO）在細胞中積累，幫助細胞適應環境變化，影響蛋白質聚集，對心血管疾病研究至關重要。體外研究表明滲透物能夠熱穩定蛋白，但機制仍有爭議，并在細胞環境中缺乏系統的研究。LiP-MS可以檢測蛋白質的聚集變化，但是LiP-MS數據本身無法明確區分聚集與其它導致蛋白酶敏感性降低的結構變化，因此引入了TPP來監測蛋白質的熱誘導聚集來評估其熱穩定性，從而補充LiP-MS數據，為研究提供了更全面的視角。

技術流程

LiP–MS thermal profiling（LiP-MS+TPP）是將蛋白酶K（PK）添加到暴露于溫度梯度的天然裂解物等分液中，PK可切割蛋白的柔性和可接近區域，隨著溫度的升高，蛋白聚集，越來越少的區域被PK切割，通過檢測不同溫度梯度下產生的不同肽段豐度，以產生每種蛋白的熱剖面。

實驗流程

實驗結果

一、滲透劑對大腸桿菌蛋白質組熱穩定性的影響

作者首先來評估不同滲透劑對大腸桿菌蛋白質組熱穩定性的影響。通過將大腸桿菌裂解液暴露于六種不同的滲透劑（包括TMAO、甜菜堿、甘油、脯氨酸、海藻糖和葡萄糖），觀察到這些化學物質如何影響蛋白質的熱穩定性。研究結果顯示，所有測試的滲透劑都能在一定程度上提高蛋白質的熱穩定性。其中，TMAO顯示出最強的穩定效果，能夠穩定大部分檢測到的蛋白質（67.2%），而甘油的穩定效果相對較弱。這些發現為理解滲透劑如何在細胞內環境中保護蛋白質免受熱變性提供了新的見解，并可能對開發新的蛋白質穩定化策略具有重要意義。

滲透劑對大腸桿菌蛋白質組熱穩定性的影響

二、滲透劑誘導的蛋白質聚集溫度上移來抵抗蛋白沉降

實驗觀察到所有測試滲透劑均促使蛋白質聚集的溫度閾值上移，這一現象揭示了滲透劑通過增強蛋白質結構的穩定性，有效延遲了蛋白質的聚集過程。

滲透劑誘導的蛋白質聚集溫度上移來抵抗蛋白沉降

三、滲透劑通過優先排斥機制穩定蛋白

該研究利用HEK293T細胞模型，采用LiP–MS thermal profiling深入分析多種滲透劑對人類蛋白質組熱穩定性的影響。結果發現滲透劑主要通過優先排斥機制來穩定蛋白質，即滲透劑與蛋白質相互排斥，使得蛋白質更傾向于保持其緊密折疊的狀態，從而在細胞內環境中增強了蛋白質的熱穩定性。此外，還發現特定蛋白質可能通過與滲透劑的直接結合來增強熱穩定性。

滲透劑通過優先排斥機制穩定蛋白

四、TMAO滲透劑的特異性效應

盡管多數滲透劑對蛋白質的穩定作用具有普遍性，但特定滲透劑如TMAO對有結構的蛋白質和無序蛋白質的影響存在差異，能夠穩定球狀蛋白質同時促進大型無序蛋白質的聚集。

TMAO滲透劑的特異性效應

實驗結論

LiP–MS thermal profiling技術不僅深化了我們對細胞借助滲透劑應對環境壓力機制的認識，還為探究蛋白質在多變環境條件下的穩定性與功能活性提供了強有力的分析平臺。此技術在藥物研發領域尤其重要，它有助于篩選和優化潛在藥物分子，評估它們對蛋白質穩定性及聚集行為的作用，進而提升藥物的有效性并降低潛在的副作用風險。

藥物靶點在醫藥研發中至關重要，它們是藥物作用的生物分子，涵蓋蛋白質、酶、受體等，對調節生物體的生理和病理過程起著決定性作用。藥物靶點的發現和驗證是新藥研發的首要步驟，直接關系到研發的成敗。青蓮百奧生物科技有限公司專注于臨床需求，以源頭創新為動力，利用其專業平臺，結合限制性酶解-質譜分析技術（LiP-MS）和熱蛋白質組學（TPP），打造了高效的藥物靶點發現平臺。這一平臺不僅加速了藥物篩選過程，還提高了藥物的療效和安全性，為個性化醫療提供了強有力的技術支持。

參考文獻：

[1] Pepelnjak M, Velten B, N?pflin N, et al. In situ analysis of osmolyte mechanisms of proteome thermal stabilization [J]. Nature Chemical Biology, 2024, 20(8): 1053-1065.