熱(re)(re)蛋(dan)白(bai)質(zhi)組(zu)學(xue)（Thermal Proteome Profiling，TPP）由德(de)國海(hai)德(de)堡的(de)歐(ou)洲分子(zi)生物(wu)學(xue)實(shi)驗室(shi)（EMBL）的(de)Mikhail M. Savitski教(jiao)授自2014年起領導開發，融合了(le)細胞熱(re)(re)漂移(yi)測(ce)定（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）的(de)原(yuan)理(li)和(he)多重定量質(zhi)譜的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)組(zu)學(xue)方法(fa)，能(neng)夠監測(ce)數千種蛋(dan)白(bai)質(zhi)的(de)熔解曲線(xian)。自推(tui)出以(yi)來，它已被全(quan)球藥物(wu)靶點研(yan)究領域的(de)科學(xue)家們(men)廣泛認(ren)可和(he)推(tui)崇。
TPP技術(shu)的(de)(de)(de)原理是基于(yu)配體與(yu)靶蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白結合后，通過(guo)(guo)改變其構象、增(zeng)(zeng)強疏水(shui)性(xing)或形成(cheng)化學交(jiao)聯，從而改變靶蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白的(de)(de)(de)熱穩(wen)定(ding)性(xing)。這種穩(wen)定(ding)性(xing)可以(yi)(yi)通過(guo)(guo)測(ce)量蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)熱變性(xing)中點(dian)溫(wen)度(du)（Tm）來評估，即蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)解折疊50%時對應的(de)(de)(de)溫(wen)度(du)。在(zai)經(jing)典流程中，細(xi)胞或細(xi)胞提(ti)取(qu)物被分為(wei)10份，分別在(zai)37-67℃的(de)(de)(de)遞增(zeng)(zeng)溫(wen)度(du)下加熱，以(yi)(yi)覆(fu)蓋大多(duo)數(shu)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)熔點(dian)范圍。加熱后提(ti)取(qu)的(de)(de)(de)可溶(rong)性(xing)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)通過(guo)(guo)穩(wen)定(ding)同(tong)位素標記試劑TMT10進(jin)行(xing)標記，然后混合所有樣品并利用質(zhi)(zhi)譜技術(shu)進(jin)行(xing)數(shu)據(ju)依賴(lai)采集(ji)（DDA）分析。通過(guo)(guo)比較有無配體結合的(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)Tm和熔解曲線(xian)，可以(yi)(yi)確定(ding)靶蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白。
TPP實驗原理(li)及流(liu)程
在熱蛋白質組分析(xi)(xi)（TPP）中，數(shu)據依賴性(xing)采(cai)集（DDA）結合(he)TMT標(biao)記技術，通(tong)過多路(lu)復用樣本提高了(le)定量精(jing)度。但隨(sui)著(zhu)數(shu)據獨立(li)采(cai)集（DIA）技術的(de)(de)(de)發展，它以(yi)更高的(de)(de)(de)靈(ling)敏度和更全面的(de)(de)(de)蛋白質覆蓋率，以(yi)及降低(di)的(de)(de)(de)成本和簡(jian)化的(de)(de)(de)樣品制(zhi)備流程，對(dui)TMT-DDA的(de)(de)(de)TPP分析(xi)(xi)方法提出了(le)有力的(de)(de)(de)挑戰(zhan)，特別是在需要大規模蛋白質組學研究的(de)(de)(de)場合(he)。。
2023年英(ying)國紐卡斯爾大學(xue)Maria Emilia Due?as教授在(zai)期刊J Proteome Res（IF=3.8）上(shang)發表了題為(wei)“Comparison of Quantitative Mass Spectrometric Methods for Drug Target Identification by Thermal Proteome Profiling”的研究(jiu)論文，該研究(jiu)比較了TPP中的兩種定量方法--TMT-DD和DIA的表現，指出在(zai)TPP實驗(yan)方法時(shi)應考慮(lv)實驗(yan)周期、成本(ben)、定量精度、靶(ba)點(dian)全面性等因素，以確保數據質量和分(fen)析(xi)準確性。
樣本：急性(xing)髓系白(bai)血病(bing)（AML）的THP-1細胞系。
分組(zu)(zu)：藥(yao)物處理(li)組(zu)(zu)（用losmapimod處理(li)）和(he)對照組(zu)(zu)（DMSO處理(li)）。
數目：8個不同的溫度點（40℃, 44℃,48℃, 52℃, 56℃, 60℃, 64℃, and 68℃）進行。
重復：三次生物學重復。
數(shu)據處理：五組(zu)，分別為：TMT-DDA組(zu)、Direct DIA組(zu)、DDA library組(zu)、Hybrid library組(zu)和DIA-NN組(zu)（Library free組(zu)）。
TPP不(bu)同(tong)方法比較實驗流程(cheng)
TMT-DDA周期更短
對于實(shi)驗人(ren)員而言，時間就是效率。在對TMT-DDA與DIA方法(fa)的(de)全面比較中，我們發現(xian)TMT-DDA以其快速的(de)樣(yang)品準(zhun)備和(he)高效的(de)數據分析，脫穎而出(chu)成為用時最短的(de)方法(fa)。這對于追求實(shi)驗速度和(he)效率的(de)科(ke)研工作者來說，無疑是個(ge)令人(ren)欣慰(wei)的(de)選擇。
TMT-DDA方法的樣品準備時(shi)(shi)間(jian)大約是24小(xiao)時(shi)(shi)，但(dan)質譜(pu)分析時(shi)(shi)間(jian)是75小(xiao)時(shi)(shi)，使(shi)得(de)總體時(shi)(shi)間(jian)相對較短。DIA方法的樣品準備時(shi)(shi)間(jian)大約是8小(xiao)時(shi)(shi)，但(dan)質譜(pu)分析時(shi)(shi)間(jian)需要96小(xiao)時(shi)(shi)（涉及每個樣品的單次上機（single-shot）分析），因此(ci)總體時(shi)(shi)間(jian)較長。
TPP不同方法用(yong)時比(bi)較
整(zheng)體蛋白檢測深度不分上下(xia)
其次關(guan)心的就(jiu)是(shi)蛋(dan)白的鑒(jian)定深度了(le)，若改變方法(fa)(fa)導致(zhi)蛋(dan)白鑒(jian)定數目大(da)(da)幅下降，那無疑是(shi)得(de)不償失了(le)。通過對不同(tong)方法(fa)(fa)的蛋(dan)白以及肽段鑒(jian)定數目的比較(jiao)，發現DIA-NN在蛋(dan)白質(zhi)(zhi)鑒(jian)定深度上表現出色。雖然DDA與DIA的檢測方法(fa)(fa)差(cha)別較(jiao)大(da)(da)，但是(shi)所(suo)有方法(fa)(fa)之(zhi)間(jian)(jian)發現了(le)已鑒(jian)定蛋(dan)白質(zhi)(zhi)組的相(xiang)當大(da)(da)的重疊，與之(zhi)前(qian)的研究一致(zhi)， DIA方法(fa)(fa)和TMT-DDA之(zhi)間(jian)(jian)平均67%的蛋(dan)白質(zhi)(zhi)組是(shi)共(gong)有的。
TPP不同方法蛋白鑒定深(shen)度比較
熱熔(rong)曲線擬合不分(fen)上下
在熱(re)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)組分(fen)(fen)析(xi)（TPP）中，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)鑒定數(shu)目是評估分(fen)(fen)析(xi)方法性能的(de)(de)一個關鍵(jian)指標，但并非唯(wei)一標準(zhun)。研究指出，DIA-NN在低溫條件下鑒定的(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質數(shu)目更多，而(er)TMT-DDA在高(gao)溫條件下表現更佳，而(er)高(gao)低溫的(de)(de)數(shu)據對于生成可靠的(de)(de)熔(rong)(rong)解(jie)曲線(xian)至(zhi)關重(zhong)要。在擬合熱(re)熔(rong)(rong)曲線(xian)時(shi)，只有滿足R2≥0.8和平臺(tai)值(zhi)≤0.3的(de)(de)曲線(xian)才被納(na)入分(fen)(fen)析(xi)，以確(que)保(bao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質熔(rong)(rong)點(dian)計算的(de)(de)準(zhun)確(que)性。TMT-DDA平均量化了4497個蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)曲線(xian)，而(er)DIA-NN生成了4458條曲線(xian)，略少于TMT-DDA。此(ci)外(wai)在選擇(ze)分(fen)(fen)析(xi)方法時(shi)需考慮實驗設計和目標蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)熔(rong)(rong)點(dian)的(de)(de)特性，以確(que)保(bao)數(shu)據質量和分(fen)(fen)析(xi)準(zhun)確(que)性。
TPP不同方法蛋白(bai)擬合(he)曲(qu)線比(bi)較
TMT的壓縮效應
在TPP分(fen)析中，TMT標記可能(neng)(neng)會影響測量(liang)(liang)敏感度(du)。研究以藥(yao)物losmapimod的(de)已知靶標MAPK14為例，發現DIA成功實現了(le)從對照組的(de)44.6 ± 0.1°C到實驗(yan)組的(de)50.0 ± 0.3°C的(de)精(jing)確溫度(du)變(bian)化測量(liang)(liang)。相(xiang)比(bi)之下，TMT-DDA方法(fa)測得的(de)MAPK14的(de)熔解溫度(du)比(bi)DIA平均高出0.9°C，這可能(neng)(neng)源于(yu)前體離子共分(fen)離導致(zhi)的(de)定(ding)量(liang)(liang)準確性(xing)降低(di)，比(bi)率壓縮造成的(de)熱(re)位移測量(liang)(liang)不足，DIA方法(fa)顯示(shi)出對熱(re)穩(wen)定(ding)性(xing)微小變(bian)化的(de)高敏感性(xing)。
藥(yao)物靶點(dian)MAPK14在(zai)不同檢測方法中(zhong)的(de)表現
TMT-DDA熱位移定量精度更佳
在(zai)評估熔(rong)(rong)解(jie)曲(qu)線的(de)蛋白(bai)質(zhi)的(de)熱位(wei)移(yi)時，研究觀察到LFQ-DIA相較于TMT-DDA產生了(le)略高(gao)的(de)平均(jun)熱位(wei)移(yi)（0.6 ± 1 °C對比(bi)-0.2 ± 1 °C），暗(an)示了(le)LFQ-DIA在(zai)定(ding)量(liang)上(shang)的(de)微(wei)弱不(bu)精確性(xing)。此(ci)外(wai)，在(zai)較高(gao)溫度(du)下，LFQ-DIA在(zai)熔(rong)(rong)點測定(ding)的(de)精度(du)上(shang)不(bu)如TMT-DDA。DIA方(fang)(fang)法在(zai)蛋白(bai)質(zhi)組成一致的(de)樣本中最為準(zhun)確，因(yin)(yin)為它依賴于可比(bi)的(de)肽段剖面進行無標記定(ding)量(liang)。在(zai)較低溫度(du)時，由于蛋白(bai)質(zhi)熔(rong)(rong)解(jie)較少，DIA能提供可靠的(de)定(ding)量(liang)結果。但在(zai)較高(gao)溫度(du)下，許多蛋白(bai)質(zhi)可能已經達(da)到其(qi)熔(rong)(rong)點，此(ci)時LFQ-DIA的(de)定(ding)量(liang)準(zhun)確性(xing)可能降低。因(yin)(yin)此(ci)，在(zai)涉及較高(gao)溫度(du)范(fan)圍的(de)實驗設計(ji)中，TMT-DDA因(yin)(yin)其(qi)在(zai)準(zhun)確性(xing)和可靠性(xing)上(shang)的(de)輕微(wei)優勢，應(ying)被考慮作為首選方(fang)(fang)法。
TMT-DDA熱(re)位移定量精度更佳
TMT-DDA鑒定靶點更全面
在(zai)(zai)(zai)分析(xi)不(bu)同(tong)質(zhi)譜方(fang)法篩選(xuan)藥物(wu)靶點的(de)能力時(shi)，研究發現TMT-DDA技術能夠鑒定(ding)出(chu)DIA方(fang)法未能檢測(ce)到(dao)的(de)2個靶點。其(qi)中一個蛋白靶點的(de)熱(re)穩定(ding)性(xing)增加，而(er)(er)在(zai)(zai)(zai)DIA數(shu)據中并未被(bei)捕捉到(dao)，這(zhe)(zhe)提醒后續研究在(zai)(zai)(zai)方(fang)法選(xuan)擇上需謹慎。此外，TMT-DDA還(huan)鑒定(ding)出(chu)另一個靶點，其(qi)在(zai)(zai)(zai)DIA數(shu)據中因生(sheng)物(wu)重復間(jian)的(de)高變異性(xing)而(er)(er)被(bei)濾除，這(zhe)(zhe)暗示TMT-DDA在(zai)(zai)(zai)處理噪(zao)聲方(fang)面可能具有更高的(de)容忍度。這(zhe)(zhe)些發現突顯了(le)在(zai)(zai)(zai)藥物(wu)靶點鑒定(ding)中，不(bu)同(tong)質(zhi)譜采(cai)集技術各有優勢，同(tong)時(shi)也揭示了(le)它們在(zai)(zai)(zai)數(shu)據解析(xi)上的(de)特定(ding)局限性(xing)。
在(zai)評估TPP實驗的(de)(de)檢測方(fang)(fang)法時，盡管TMT-DDA和(he)DIA在(zai)蛋白鑒(jian)定(ding)(ding)(ding)和(he)曲線擬合上(shang)各有所長(chang)，但TMT-DDA以其快速(su)的(de)(de)實驗周期和(he)在(zai)高溫區域的(de)(de)高定(ding)(ding)(ding)量精度(du)而更具優勢，在(zai)熱位(wei)移定(ding)(ding)(ding)量精度(du)上(shang)略勝一籌。然而，也需注意TMT標(biao)記可能導致(zhi)的(de)(de)壓縮效(xiao)應，這可能會影響Tm值的(de)(de)準(zhun)確測量。因此，選(xuan)擇最佳方(fang)(fang)法時，應綜合成本、實驗效(xiao)率(lv)、定(ding)(ding)(ding)量準(zhun)確性和(he)靶點鑒(jian)定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)全面性做出選(xuan)擇~
藥物靶點在醫(yi)藥研(yan)發中至關(guan)重要，它們是藥物作(zuo)用(yong)的生物分子，涵蓋蛋白質、酶、受體等(deng)，對(dui)調節(jie)生物體的生理和(he)(he)病理過程起(qi)著(zhu)決定(ding)性作(zuo)用(yong)。藥物靶點的發現和(he)(he)驗(yan)證是新藥研(yan)發的首要步驟，直(zhi)接關(guan)系到(dao)研(yan)發的成敗。青蓮百奧生物科(ke)技有(you)限(xian)公(gong)司(si)專注(zhu)于臨床需(xu)求(qiu)，以源頭(tou)創新為動力，利用(yong)其專業平臺，打造(zao)了熱蛋白質組學（TPP）的藥物靶點解(jie)決方(fang)案，并產出了國(guo)內首篇TPP項目文章，歡迎大家前來(lai)咨詢(xun)~
參考文獻
[1] Savitski M M, Reinhard F B M, Franken H, et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome [J]. Science, 2014, 346(6205).
[2] George A L, Sidgwick F R, Watt J E, et al. Comparison of Quantitative Mass Spectrometric Methods for Drug Target Identification by Thermal Proteome Profiling [J]. Journal of Proteome Research, 2023, 22(8): 2629-2640.
